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细胞拉伸仪在间充质干细胞的应用

更新时间:2023-02-17 点击量:716

1. 简介

Runx2(Runt相关转录因子2早期称为核心结合因子α-1(Cbfa1))是间充质干细胞(MSCs)成骨细胞分化和骨形成的重要转录因子。在 Runx2 中具有纯合突变的小鼠表现出胚胎牙齿发育停滞,由于缺乏成骨细胞分化而没有膜内和软骨内骨化,并且是胚胎致命的。Runx2 被体内小鼠皮质骨中的流体剪切应力激活,据报道拉伸和流体剪切应力等机械应力可增强成骨细胞中 Runx2 的表达并促进其在体外成骨细胞分化。这些发现表明,Runx2调节成骨细胞中的机械转导以形成骨。然而,Runx2在机械应力诱导的骨形成中的生物学功能的潜在机制尚未阐明。

在本研究中,我们研究了Runx2在机械拉伸诱导骨重塑中的功能,通过在Runx2中对牙齿施加正畸力+/−小鼠,CCD的动物模型。我们研究了Runx2中的增殖和成骨细胞分化+/−实验牙齿运动的张力侧小鼠,以及源自Runx2的拉伸BMSC中的小鼠+/−小 鼠。最后,我们研究了mTORC2在Runx2中BMSC的机械拉伸诱导增殖和成骨细胞分化中的激活+/−小 鼠。

2. 材料和方法

2.7. 细胞培养

后,股骨和胫骨为6-9周龄野生型和Runx2+/−仔细清除小鼠贴壁软组织中的细胞并收获骨髓细胞。收集的细胞以4×10的密度接种7每3.5厘米组织培养的细胞并在生长培养基中培养:Dulbecco的改良Eagle中低葡萄糖含有10%热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素,在 37 °C 的 5% CO 中2 大气层。培养4天后,去除非贴壁细胞,再培养贴壁细胞3天,直到90%汇合,在本研究中用作BMSC。为了促进成骨,BMSCs在成骨培养基中培养:补充有10nM地塞米松(Sigma),82μg/ ml l-抗坏血酸(Wako)和10mM β-甘油磷酸盐(Sigma)的生长培养基,在37°C的5%CO2大气层。每三天更换一次成骨培养基。

2.8. 机械拉伸在细胞上的应用

BMSCs在10厘米上播种在细胞拉伸腔室,涂有0.05mg / ml纤连蛋白(Sigma)并以12×1的密度培养10小时5细胞/厘米2.在细胞达到亚汇合后,使用专门设计的装置拉伸它们,该装置使腔室宽度单轴增加12%。拉伸值是根据拉伸诱导的BMSC增殖数据确定的。在使用抑制剂的情况下,在与抑制剂孵育1小时后拉伸细胞。未拉伸的细胞在相同条件下孵育并用作对照。

3. 结果

3.3. 拉伸对野生型和Runx2中BMSC增殖的影响+/−小 鼠

在牙齿运动的张力侧,PDL中招募的MSC在牙槽骨表面迅速增殖,并启动成骨细胞的分化(Pavlin和Gluhak-Heinrich,2001)。 然后发生细胞外基质的矿化并促进骨形成(Pavlin和Gluhak-Heinrich,2001)。阐明Runx2中牙齿运动张力侧骨形成减少的机制+/−小鼠,我们拉伸小鼠BMSC并在体外检查拉伸诱导的成骨细胞功能。我们检查了野生型和Runx2中的DNA含量+/−拉伸后的BMSCs评估Runx2是否与成骨细胞谱系细胞的增殖有关。未拉伸(对照)野生型和Runx2中的DNA含量+/−BMSC增加并在机械负荷开始后48小时达到峰值(图4A)。卸载野生型和Runx2之间的DNA含量没有显着差异+/−BMSC从0到48小时(图4A)。在野生型BMSC中,机械刺激在拉伸12和24小时时显着增加了DNA含量,在24小时达到峰值(图4A)。同时,来自Runx2的DNA含量+/−BMSC在12和24小时拉伸显着增加,并在36小时观察到峰值(图4A)。Runx2+/−与野生型BMSC相比,BMSC在24 h时表现出显着降低拉伸诱导的DNA含量增加,而拉伸野生型和Runx2+/−BMSC在12、36和48小时没有差异(图4A)。此外,我们使用CCK-8进一步定量评估了BMSC的细胞增殖。在机械负荷开始2小时后,机械拉伸增加了野生型和Runx<>的增殖+/−BMSC,更重要的是拉伸的Runx2+/−与野生型BMSC相比,BMSC显着增殖。

细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)是驱动细胞周期的生长因子介导信号的整合因子(Baldin等人,1993;林和卡尔迪斯,2013 年)。生长因子促进细胞周期的G1期,D型细胞周期蛋白主要作为生长因子传感器(Baldin等人,1993;林和卡尔迪斯,2013 年)。p21和p27是细胞周期蛋白D-cdk4复合物的紧密结合抑制剂并抑制G1进展(Harper等人,1993;波利亚克等人,1994年)。我们评估了细胞周期调节蛋白在野生型和Runx2中的表达+/−在拉伸开始后6和12小时BMSC检查细胞周期进程与拉伸的关联。细胞周期蛋白D在未拉伸的野生型和Runx2中得到增强+/−BMSC在12小时与0小时相比(图4B)。拉伸在野生型BMSC中6小时和Runx2中显着诱导的周期蛋白D+/−12小时的BMSCs(图4B)。 p21蛋白在未拉伸的野生型和Runx2中的表达+/−BMSCs从0到6小时没有变化,但从6小时减少到12小时,尽管Runx2+/−无论机械负荷如何,BMSC在21至0 h期间的p12表达都明显高于野生型BMSC(图4B)。在野生型BMSC中,拉伸减弱p21在6小时时表达,但在12小时时不表达,而在Runx2+/−BMSC,在21和6小时拉伸减弱p12表达(图4B)。从27到0小时,BMSCs中p12表达几乎没有差异,无论负载和Runx2基因剂量如何(图4B)。

这些发现表明,拉伸增加了BMSC的增殖并调节了细胞周期进程,而Runx2基因剂量的减少延迟了机械刺激诱导的BMSCs增殖。

3.4. 拉伸对野生型和 Runx2 BMSC 成骨的影响+/−小 鼠

接下来,我们将拉伸加载到野生类型和 Runx2 上+/−成骨培养基中的BMSCs,研究Runx2对牵伸诱导的成骨细胞分化的影响。在未拉伸的野生型和 Runx2+/−BMSCs,ALP活性,一种早期成骨标志物,在拉伸开始后0至21天逐渐增加,此后下降,直到第28天,两种基因型之间没有显着差异(图4C)。在野生型BMSC中,拉伸在第7天和第14天显着增加了ALP活性,并且在第7天ALP活性达到峰值(图4C)。在 Runx2 中+/−BMSC,机械刺激在第14天显着增强了ALP活性,但在第7天没有,并且在第21天观察到ALP活性的峰值。此外,杂合子Runx2缺乏症在第14天显着降低了BMSC中拉伸诱导的ALP活性(图4C)。拉伸诱导的 Runx2 中 ALP 活性峰值+/−BMSC显著低于野生型BMSCs(图4C)。

机械负荷在拉伸开始后第14天显著增加了野生型BMSC中的OSC mRNA表达,拉伸诱导的OSC mRNA表达在第21天达到峰值,此后下降(图4D)。相反,拉伸显着诱导了Runx2中的OSC mRNA表达+/−BMSC在第21天,但不在第14天(图4D)。Runx2+/−BMSC的拉伸诱导OSC mRNA表达峰明显低于野生型BMSCs(图4D)。

我们进一步研究了拉伸诱导的基质沉积钙,这是成骨的晚期标志物,在野生型和Runx2的BMSC中+/−小鼠(图4E)。在卸载的百搭型和 Runx2 中+/−BMSCs,钙含量持续增加,直到拉伸开始后第28天,但野生型和Runx2之间没有显着差异+/− (图4机械负荷在第21天和第28天以及Runx2中显着提高了野生型BMSC的钙含量。+/−BMSC在第28天,但不在第21天(图4E)。第28天,Runx2中拉伸诱导的钙含量+/−BMSC明显低于野生型BMSC(图4E)。

此外,野生型和Runx2+/−BMSC在机械刺激开始后第7天染色ALP,第21天染色茜素红(图4F和G)。拉伸导致两种基因型的ALP和茜素红色显着染色(图4F和G)。未拉伸和拉伸的 Runx2+/−BMSC的染色率低于相应的野生型BMSC(图4F和G)。

综上所述,我们发现拉伸增强了野生型和Runx2的成骨作用。+/−BMSC,但 Runx2+/−与野生型BMSC相比,BMSCs显示出拉伸诱导的成骨细胞分化减少和延迟。

3.5. 肺泡骨张力侧成骨细胞中的 mTOR 和 Rictor 蛋白表达

评估mTORC2与Runx2中牙齿运动延迟张力侧骨形成的相关性+/−小鼠,我们在实验牙齿运动的张力侧检查了成骨细胞中mTOR和Rictor的蛋白质表达。

在开始实验牙齿移动之前(第0天),mTOR和Rictor在PDL中以野生型和Runx2表达+/−老鼠,虽然 Runx2+/−与野生型同窝小鼠相比,小鼠表现出两种蛋白质的表达较弱(图5H,N,h和n,箭头)。在实验性牙齿运动的第1天和第3天,在野生型小鼠实验牙齿运动的张力侧检测到成骨细胞中mTOR和Rictor表达增强(图5J,P,L和R,箭头),而Runx2+/−小鼠在第3天表现出这些蛋白质的较弱表达(图5j,p,l和r,箭头)。在Runx2成骨细胞中未检测到mTOR和Rictor的表达+/−第1天的小鼠(图5i,j,o和p)。我们在牙齿运动开始后的第3天使用野生型小鼠作为阴性对照,并且没有表达(数据未显示)。

5. 结论

我们证明了Runx2中的牙齿移动延迟+/−小鼠与野生型小鼠的比较。这促使我们使用 Runx2+/−小鼠作为RUNX2CCD患者延迟正畸牙齿运动的模型+/−.此外,我们还展示了 Runx2+/−BMSCs减少拉伸诱导的增殖,并通过mTORC2激活分化为成骨细胞。我们的研究结果表明,Runx2与mTORC2 / Akt激活的关联是牙齿运动过程中拉伸诱导的成骨细胞增殖和分化的关键作用之一。


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